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1、单孢子的分离法：此方法主要用于获得纯培养的单孢子，单孢子的分离可以通过在菌丝生长旺盛的幼嫩组织中寻找单核菌丝，或通过子实体采集单孢子，常用的单孢子分离法包括孢子印片法、稀释涂布法和组织分离法中的单点分离法等，孢子印片法是将孢子印在琼脂培养基上，通过显微镜观察并分离出单孢子，稀释涂布法则是将菌液稀释后涂布在平板培养基上，通过培养后挑选出单菌落，单点分离法则是通过显微镜直接观察菌落菌丝，找到生长点进行分离，这些方法都可以得到纯的单孢子菌落。
2、菌丝分离法：这是一种常用的食用菌菌种分离方法，通过从食用菌的子实体或菌丝组织上切取一小块，经过消毒后放在斜面培养基上培养，从而获得纯菌种，这种方法适用于大多数食用菌的分离，组织分离法是最常用的方法，适用于各种食用菌的分离，它通过切割子实体或菌丝体组织块，并将其放置在斜面培养基上培养来获得菌种，操作简单，成功率高。
在食用菌生产中，最常用的菌种分离方法是菌丝分离法中的组织分离法，这种方法简单易行，适用于各种食用菌的分离，并且可以获得较高的成功率，随着科技的发展，一些新的技术如原生质体分离技术也在逐渐应用于食用菌的分离中，原生质体分离技术具有许多优势，如可以突破细胞壁的障碍，实现基因的交流和转移等。
食用菌菌种的分离方法包括单孢子的分离法和菌丝分离法等多种方式，其中组织分离法是生产中应用最广泛的，随着技术的进步，一些新技术也在逐渐应用于食用菌种的分离中。